Gen Terapisi Ürünlerinin Viral Temizleme Doğrulama Çalışma Protokolleri için Temel Tasarım Hususları

ICH Q5A(R2)-Uluslararası Uyumlaştırma Vakfı

ICH Q5A(R2) 1 Kasım 2023'te resmi olarak kabul edildi ve viral güvenlik değerlendirmesi için temel uluslararası kılavuz belgeyi temsil ediyor. 1999'da yayınlanan Q5A(R1) ile karşılaştırıldığında, R2 sürümündeki önemli güncellemeler şunları içermektedir: sürekli üretimde viral güvenlik değerlendirmesine ilişkin yeni eklenen bir bölüm (Bölüm 7); viral temizleme stratejilerinin temeli olarak risk değerlendirmesinin güçlendirilmiş rolü; yeni{10}}nesil sıralamanın (NGS) viral tespit hususlarına dahil edilmesi; ve yeni ürünlerin ve üretim süreçlerinin değerlendirilmesine yönelik açık gereklilikler. Q5A(R2), dünya çapında viral temizleme doğrulaması için birleşik bir teknik çerçeve sağlayarak FDA, EMA ve PMDA dahil olmak üzere düzenleyici otoriteler tarafından benimsenmiştir.

NMPA-Çin Düzenleme Sistemi

Viral güvenlik için NMPA düzenleyici çerçevesi birden fazla düzeyi kapsar:

Belge Düzeyi	Belge Adı	Yayın Yılı
Temel belge	Kan Ürünlerinden Virüslerin Temizlenmesi/İnaktivasyonuna İlişkin Teknik Kılavuz	2002
Temel belge	Biyolojik Doku-Türetilmiş Ürünler ve Ökaryotik Hücre-İfade Edilmiş Ürünlerin Viral Güvenlik Değerlendirmesinin Teknik İncelemesine İlişkin Genel İlkeler	2005
Ürüne-özel yönerge	İn Vivo Gen Terapisi Ürünlerine Dayalı Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs (rAAV) Vektörü- için Farmasötik Araştırma ve Klinik Araştırma Başvurularının Değerlendirilmesine İlişkin Teknik Kılavuzlar	2023
Ürüne-özel yönerge	Pazarlama Ruhsat Başvuruları için Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs (rAAV) Vektörü-Temelli İn Vivo Gen Terapisi Ürünlerinin Farmasötik Kalitesine İlişkin Ortak Teknik Gereksinimler	2025
Yenilikçi kılavuz	Terapötik Rekombinant Protein Ürünlerinin Klinik Deneme Uygulamalarına Yönelik Viral Temizleme Süreçlerinin Platform Doğrulamasına İlişkin Teknik Kılavuzlar (Deneme)a	2024

a: Bu kılavuz, Çin düzenleyici otoritesinin viral temizleme süreçlerinin platform doğrulaması için sistematik teknik gereklilikler ortaya koyduğu ilk seferdir ve ICH Q5A(R2) ruhuyla uyumludur.

FDA ve EMA-ABD ve Avrupa Düzenleme Gereksinimleri

FDA, Ocak 2024'te resmi olarak ICH Q5A(R2)'ye dayanan bir endüstri kılavuzu belgesi yayınladı. Ayrıca, Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) bölümü<1050.1>Viral temizleme prosedürlerinin tasarımı, değerlendirilmesi ve karakterizasyonu konusunda tamamlayıcı teknik rehberlik sağlar. FDA her iki yılda bir Viral Temizleme Sempozyumu düzenlemektedir; 2023 sempozyumunda yeni modaliteler, sürekli üretim, yeni kromatografi ortamı ve soğurma filtreleri gibi{2}}en son konular ele alındı. EMA'nın temel kılavuz belgeleri arasında her ikisi de ICH ile uyumlu hale getirilmiş olan CPMP/BWP/268/95 (Virüs Doğrulama Çalışmalarına İlişkin Kılavuz Notu: Virüslerin İnaktivasyonunu ve Uzaklaştırılmasını Doğrulayan Çalışmaların Tasarımı, Katkısı ve Yorumlanması) ve EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Biyoteknolojik Araştırma Amaçlı Tıbbi Ürünlerin Virüs Güvenliği Değerlendirmesine İlişkin Kılavuz) bulunmaktadır. Q5A(R2).

Viral Kontaminasyon Kaynaklarının Belirlenmesi

ICH Q5A(R2), viral temizlenme doğrulama tasarımının kapsamlı bir risk değerlendirmesine dayanması gerektiğini vurgulamaktadır. Gen terapisi ürünleri için viral kontaminasyon kaynaklarının tanımlanması aşağıdaki seviyeleri ele almalıdır:

Hücre bankası seviyesi: Üretim hücresi substratlarında potansiyel olarak barındırılan endojen virüsler (örn., retroviral parçacıklar) ve latent olarak bulaşıcı virüsler (örn., HEK293, CHO, HeLa). HEK293 hücrelerinin endojen Ad5 E1 dizileri ve yaklaşık 900 bp'lik bir EBV fragmanı içerdiği ve replikasyon-yetkili adenovirüsü eksprese edebildiği bilinmektedir; bu nedenle risk değerlendirmesinde bu riske özellikle dikkat edilmelidir.

Yardımcı virüs düzeyi: AAV vektörü üretiminde tipik olarak replikasyon-yetkili adenovirüs (RCA) oluşturma riski taşıyan yardımcı plazmidler kullanılarak üçlü transfeksiyon gibi yöntemler kullanılır. Benzer şekilde, lentiviral vektör üretiminde kullanılan paketleme hücreleri, replikasyon-yetkili lentivirüs (RCL) oluşturabilir.

Hammadde seviyesi: Maceracı virüsler, hücre kültürü ortamı, yemler ve enzimler de dahil olmak üzere üretimde kullanılan ham maddeler yoluyla bulaşabilir. Bu risk, hayvan-türevi bileşenler kullanıldığında özellikle önemlidir (örneğin, fetal sığır serumu, trypsin sindirimi çözeltileri).

Risk Farklılıkları: Gen Terapisi ve Geleneksel Rekombinant Proteinler

Risk Boyutu	Geleneksel Rekombinant Protein Ürünleri	Gen Terapi Ürünleri
Viral kaynak	Hücre bankasından endojen virüsler; tesadüfi virüsler	Hücre bankası virüsleri; yardımcı virüsler; çoğaltma-yetkili vektörler (RCV/RCL); konak genom entegrasyonu
Hücre substratı	CHO, NS0, Sp2/0 ve diğer-iyi karakterize edilmiş hücre çizgileri	HEK293, HeLa, CHO, vb.; bazı hücre dizileri tümörijenik kökenlidir
Ürün özellikleri	Protein-bazlı ilaç; iyi-tanımlanmış yapı	Viral vektör; biyogüvenlik riskleri oluşturur
Doğrulama stratejisi	Çok-adımlı viral temizleme; süreç adımı doğrulamaya vurgu	RCV/RCL tespiti gerekli; doğrulama ve test etme her ikisi de temel önemdedir
Platform doğrulaması	S/D, düşük pH, nanofiltrasyon gibi yerleşik proseslere uygulanabilir	Vektör türlerinin çeşitliliği nedeniyle sınırlı uygulanabilirlik

Tablo 1. Viral Güvenlik Risklerinin Karşılaştırılması: Gen Terapisi Ürünleri ve Geleneksel Rekombinant Protein Ürünleri

Genel Esaslar

Gösterge virüs seçimi, viral temizleme doğrulama protokollerinin tasarımında merkezi bir unsurdur. ICH Q5A(R2), gösterge virüs seçiminin risk değerlendirmesine dayalı olmasını ve aşağıdaki faktörlerin dikkate alınmasını gerektirir:

Virüsün üretim hücresi substratıyla ilişkisi (ilgili virüs)

Virüsün fizikokimyasal özellikleri (zarflı/zarfsız-, DNA/RNA, boyut aralığı)

Virüsün fiziksel/kimyasal tedavilere direnci

Virüsün tespit edilebilirliği ve biyogüvenliği

Gen terapisi ürünleri için gösterge virüs seçiminde ayrıca aşağıdakiler dikkate alınmalıdır: vektör virüsünün kendisinin "ilgili bir virüs" olarak rolü; yardımcı virüs kontaminasyonunun potansiyel riski; ve kopyalama yetkinliğine sahip virüslerin (RCV/RCL) -çoğaltılması için algılama ve doğrulama gereksinimleri.

Önerilen Gösterge Virüs Paneli

Virüs	Tip	Mektup	genom	Boyut (nm)	Seçimin Gerekçesi / Uygulama
MVM	Parvovirüs	Hiçbiri	ssDNA	18–26	Zarfsız{0}model; en küçük boyut ve en yüksek direnç; nanofiltrasyon doğrulaması için uygundur (genellikle rAAV vektör ürünleri için geçerli değildir)
PPV	Parvovirüs	Hiçbiri	ssDNA	18–26	Zarfsız{0}model; Kan ürünleri için yaygın olarak kullanılan gösterge virüsü
Reo-3	Reovirüs	Hiçbiri	dsRNA	60–80	Zarfsız{0}model; orta boy; yüksek fiziksel stabilite
PRV	Herpesviridae	Evet	dsDNA	150–200	Zarflı model; büyük boy; geniş ana bilgisayar aralığı
X-MuLV	Retrovirüs	Evet	ssRNA	80–110	Zarflı retrovirüs modeli; CHO-türetilmiş hücre substratları için uygun
BVDV	Flaviviridae	Evet	ssRNA	40–60	Zarflı model; kimyasal inaktivasyon yöntemlerini değerlendirmek için kullanılır (HCV vekili)
VSV	Rabdoviridae	Evet	ssRNA	70	Zarflı model; geniş pH toleransı; düşük-pH inaktivasyonu doğrulaması için uygun

Tablo 2. Gen Terapisi Ürünlerinin Viral Temizleme Doğrulaması için Önerilen Gösterge Virüs Paneli

AAV Vektör Ürünleri İçin Özel Hususlar

Rekombinant AAV vektör ürünleri için, rAAV Vektör-Tabanlı İn Vivo Gen Terapisi Ürünleri için Farmasötik Araştırma ve Klinik Deneme Uygulamalarının Değerlendirilmesine ilişkin NMPA Teknik Yönergeleri, replikasyon-yetkili AAV'nin (rcAAV) tespitine dikkat edilmesini gerektirir. rcAAV, tipik olarak yardımcı plazmid ile ürün AAV genomu arasındaki homolog rekombinasyondan ortaya çıkan, otonom replikasyon kapasitesine sahip AAV'yi ifade eder. rcAAV'nin tespiti genellikle ilaç maddesi ve saflaştırılmış ürün üzerinde ayrı ayrı gerçekleştirilen enfeksiyon analizleri veya qPCR yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilir.

AAV vektör ürünlerine yönelik aşağı akışlı saflaştırma işlemlerinin tipik olarak nükleaz sindirimi, kromatografi (AEX), nanofiltrasyon ve iyon değiştirme kromatografisini (CEX/IEX) içerdiğini belirtmekte fayda var. Geleneksel viral temizleme doğrulamasında bu işlem adımları, AAV vektörünün kendisinde önemli kayıplarla sonuçlanabilir; bu nedenle, vektör ve gösterge virüsleri arasındaki etkileşimin, ölçeği-küçültme model tasarımı sırasında dikkatle değerlendirilmesi gerekir. AAV vektör kayıplarının önemli olduğu belirli proses adımları (örn. nanofiltrasyon) için, doğrulama verilerine (örn. nanofiltrasyon membran gözenek boyutunun ayarlanması) dayalı olarak proses ayarlamalarının garanti edilip edilmeyeceği değerlendirilmelidir.

Genel Esaslar

Ölçek-küçültme modeli (SDM), viral temizlenme doğrulaması için temel araçtır; tasarımı, üretim sürecinin viral temizleme performansını doğru bir şekilde temsil etmelidir. ICH Q5A(R2), Bölüm 6.2.2, ölçek küçültme modelinin-temel parametrelerde üretim süreciyle tutarlılığını sürdürmesini açıkça gerektirir. Gen terapisi ürünleri için SDM tasarımında aşağıdaki hususlar özellikle önemlidir:

Kritik Proses Parametrelerinin Temsililiği

Ölçek-küçültme modeli aşağıdaki parametreler açısından üretim süreciyle tutarlı olmalıdır: kromatografik koşullar (tampon bileşimi, pH, iletkenlik); yükleme oranı (vektör/süpernatan protein kütle oranı); temas süresi ve sıcaklığı; akış hızı/kalış süresi; ürünün saflığı ve bileşimi. AAV ürünleri için, vektör parçacık boyutu dağılımının ve boş kapsid içeriğinin nanofiltrasyon performansı üzerindeki etkisi de özel olarak ele alınmalıdır.

Model Kalifikasyon Gereksinimleri

ICH Q5A(R2), aşağıdakileri de içeren-ölçek küçültme modelinin yeterli niteliklerini gerektirir: ürün kalitesi özelliklerinin karşılaştırılması (ör. saflık, geri kazanım, yoğunluk); kritik süreç parametresi tutarlılığının niteliği; ve ölçeği küçültme modelinin-üretim sürecinin süreç değişkenliğini yakalamasını sağlamak. Kromatografi adımları için tepe profilinin, elüsyonun ve yıkamanın tutarlılığı nitelikli olmalıdır; nanofiltrasyon adımları için hacim kapasitesinin ve ürün bileşiminin etkileri doğrulanmalıdır.

LRV Hesaplama Formülü

Log azaltma değeri (LRV), viral temizleme etkinliğini ölçmek için temel ölçümdür. ICH Q5A(R2), Bölüm 6.5, LRV hesaplama yöntemleri ve istatistiksel işlemlere ilişkin ayrıntılı bir açıklama sağlar. Temel LRV hesaplama formülü şu şekildedir: LRV=log₁₀(N₀/N), burada N₀, virüs artışından sonraki başlangıç ​​virüs titresidir ve N, işlem tedavisinden sonra kalan virüs titresidir. Artık virüs titresi testin tespit sınırının altına düştüğünde, Poisson dağılımı gibi tahmin yöntemleri kullanılmalıdır (örneğin, büyük-hacimli test).

Güven Aralıklarının Uygulanması

Hem ICH Q5A(R2) hem de EMA CPMP/BWP/268/95, LRV hesaplama sonuçlarının güven aralığı değerlendirmesini gerektirir. Tipik olarak %95'lik bir güven aralığı uygulanır.

Etkililik Kriterleri

Kan Ürünlerinden Virüslerin Kaldırılması/İnaktifleştirilmesine ilişkin NMPA Teknik Kılavuzlarına göre, 4 log'dan büyük veya eşit bir virüs azalması, işlem adımının virüsün ortadan kaldırılması/etkisizleştirilmesi için etkili olduğunu gösterir. Ancak bu kriter mutlak bir eşik değildir ve inaktivasyon kinetiği eğrileri, gösterge virüs seçiminin bilimsel mantığı ve doğrulama protokolü tasarımının genel sağlamlığı ile birlikte bütünsel bir şekilde değerlendirilmelidir. Gen terapisi ürünleri için, genel viral güvenlik profilinin kabul edilebilir bir seviyede olmasını sağlamak amacıyla tüm süreç adımlarında kümülatif temizleme kapasitesine özel dikkat gösterilmelidir.

Nanofiltrasyonun Uygulaması ve Zorlukları

Virüs-tutucu filtreleme (nanofiltrasyon), gen terapisi ürünlerinin aşağı yönde saflaştırılmasında kritik bir viral temizleme adımıdır. Tipik virüs-tutucu filtrelerin gözenek boyutu yaklaşık 20 nm'dir. Nanofiltrasyonun viral temizleme mekanizması öncelikle boyut-tabanlı dışlamadır ve MVM ve PPV gibi zarfsız küçük parvovirüsler de dahil olmak üzere, membran gözenek boyutundan daha büyük virüslerin çoğunu etkili bir şekilde ortadan kaldırabilir.

Bununla birlikte, gen terapisi ürünleri için nanofiltrasyon benzersiz zorluklarla karşı karşıyadır: AAV vektörlerinin boyutu (yaklaşık 20-26 nm), belirli gösterge virüslerinin boyutuna benzer (örneğin, MVM, 18-26 nm), bu da vektör geri kazanımının azalmasına neden olabilir; boş kapsidler filtrasyon akışını ve viral tutma verimliliğini etkileyebilir; numune viskozitesi vektör konsantrasyonuyla önemli ölçüde artabilir. Bu nedenle, nanofiltrasyon doğrulaması için SDM tasarımı, vektör parçacık boyutu dağılımının ve boş kapsid içeriğinin filtrasyon performansı üzerindeki etkilerini tam olarak hesaba katmalı ve uygun şekilde daha büyük gözenek boyutlarına sahip nanofiltrasyon membranlarının kullanılmasına dikkat edilmelidir.

Kromatografi Adımlarının Viral Temizleme Değerlendirmesi

İyon değişim kromatografisi (IEX), AAV ürün saflaştırma süreçlerinde temel bir adımdır; boş ve kusurlu kapsidleri yakalamak için tipik olarak nükleaz sindirimi ve ardından anyon değişim kromatografisi (AEX) veya tam kapsidlerin ince saflaştırılması için katyon değişim kromatografisi (CEX) kullanılır. Kromatografi adımlarındaki viral temizleme mekanizmaları arasında boyut dışlaması, elektrostatik etkileşimler, afinite etkileşimleri ve diğer faktörler bulunur. FDA 2023 Viral Temizleme Sempozyumu'ndaki tartışmalarda, kromatografi adımlarının viral temizleme etkinliğinin, yükleme kapasitesi, pH, iletkenlik ve reçine döngüsü dahil olmak üzere birçok faktörden etkilendiği vurgulandı; Kapsamlı değerlendirme için çok-faktörlü ortogonal tasarım yaklaşımı benimsenmelidir.

Sürekli Üretimde Viral Güvenlik Kontrolü

ICH Q5A(R2)'nin yeni eklenen 7. Bölümü, sürekli üretimde viral güvenlik değerlendirmesi için özel gereklilikleri ortaya koymaktadır. Gen terapisi ürünleri için sürekli üretim önemli bir gelişme yönü haline geldi, ancak aynı zamanda yeni viral güvenlik zorluklarını da beraberinde getiriyor. Sürekli üretimdeki viral güvenlik kontrol stratejileri şunları içerir: kritik kontrol önlemleri olarak-hat içi virüs bariyeri filtreleri; kalma sürelerinin ve süreç akışlarının uygun tasarımı; etkisizleştirme adımlarının tanımlanmış bekletme sürelerine dahil edilmesi; ve kritik süreç parametrelerinin gerçek zamanlı-izlenmesi için süreç analizi teknolojisinin (PAT) geliştirilmiş uygulaması.